寡核苷酸疗法的生物分析深度盘点,多样化分

一、精准医疗领域的明星——寡核苷酸

精准医疗是指将病人个体特性包括基因、环境以及生活方式等各个方面综合考虑应用于个体化疾病的预测、预防、诊断和治疗的新型医疗模式[1]。与传统医疗面向群体、对症状相同的病人使用相同药物进行治疗的方式相比，精准医疗更强调以个体数据为基础疾病预测、预防和个体化诊疗。寡核苷酸类药物通过干扰靶基因的mRNA以碱基互补配对的形式结合而导致的序列特异性基因沉默，从疾病形成的根本进行治疗，体现了此类药物治疗的高度精准性，近年来受到热捧。

近30年的临床研究中，寡核苷酸（Oligonucleotide，OGNs）药物因其能够有效调控疾病相关功能蛋白的基因表达，已被验证为一种具有广泛应用潜力的药物治疗手段[2-4]。由于其可以根据引发疾病的基因突变定制靶向序列，能够满足个性化的药物需求，并且高效，长效和低毒，这是其他药物模式所不能比拟的。

二、寡核苷酸药物的诞生

寡核苷酸疗法的成功研究始于反义寡核苷酸(ASO)、适配体，如福米韦生是首个被批准上市的反义核苷酸，是21聚体硫代磷酸寡脱氧核苷酸（其5′端附近含有一个CpG基序）在改善CMV视网膜炎的体征和症状方面非常成功。Macugen是一种长度为27个碱基靶向血管内皮生长因子(VEGF)的适配子。近年来，基于小干扰核糖核酸（siRNA）的RNA干扰疗法也受到广泛追捧，如Onpattro（patisiran），是FDA在年批准上市的脂质纳米小干扰核糖核酸复合物，靶向肝脏中的TTR信使RNA(mRNA)，长度为21-23个核苷酸，指导靶mRNA序列特异性降解的过程。

图一GalNAc：ASGPR受体的高亲和力配体

三、寡核苷酸药物成药的挑战

寡核苷酸疗法也受限于体内稳定性和安全有效的组织递送，所以往往需要对其骨架结构进行修饰，如硫代磷酸酯，糖2位羟基修饰，以增强其核酸酶稳定性[5-8]。为了寡核苷酸药物能够在体内有效的抵达靶器官发挥药效，寡核苷酸的传递机制也是寡核苷酸药物能够成功开发的关键，如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的三聚体寡核苷酸复合物，可与主要在肝脏肝细胞上表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)发生亲合力结合（图一），从而选择性的靶向肝脏[9,10]还有利用脂质体（图二），脂质纳米或者将寡核苷酸药物与脂肪酸结合，使其能够与高密度或低密度脂肪蛋白结合，极大地延长其半衰期，更能够帮助寡核苷酸药物有效的进入细胞内，发挥药物作用[11-13]。

图二脂质纳米包裹的Si-RNA模型

四、寡核苷酸药物研发中生物分析的意义和挑战

为了支持寡核苷酸药物的研究，需要经验证的高通量生物分析方法来准确和灵敏地定量生物样本中的寡核苷酸及其代谢物来评估其药代动力学和毒代动力学，如血浆、尿液和组织样本的分析工作。然而，生物样品中寡核苷酸的定量具有挑战。首先，由于与血浆蛋白高度结合，寡核苷酸的提取回收往往非常困难。第二，寡核苷酸的多聚阴离子骨架对色谱法具有挑战性，常用的解决办法是加离子对试剂，但对质谱检测器具有较大伤害。第三，由于样品中外切核酸酶和内切核酸酶的存在，寡核苷酸化合物往往存在不稳定性，需要使用无核酸酶试剂，在冰上处理样品，甚至在采样过程中加入核酸酶抑制剂。另外对于GalNAc，脂质等寡核苷酸复合体结构，又增加了生物分析方法的复杂性。如脂质体包裹的寡核苷酸药物需要考虑体内游离态和包裹态寡核苷酸的定量来反映脂质体的缓释作用等。

药明康德生物分析平台可以根据寡核苷酸的类型/大小、灵敏度、特异性和所需通量选择合适的分析工具。在项目的整个生命周期中，药明康德生物分析平台可以为不同阶段的试验提供不同的生物分析技术（表一）。我们有基于杂交的ELISA、qRT-PCR、HPLC–FLD和LC–MS(/MS)（图三）用于支持生物基质中的寡核苷酸定量。基于ELISA（图四）、PCR（图五）和FLD的检测方法依赖于目标分析物与互补链的杂交，对于设计及合成具有良好选择性试剂成为方法成败的关键。另外，ELISA和PCR不能很好的区分全长OGN和截短的代谢物，虽然方法的特异性存在不足，但方法可以得到很高的灵敏度，适用于组织样品的分析检测。基于与互补荧光探针杂交的HPLC分析和LC–MS的分析在检测水平利用色谱分离或者质谱的选择性，方法可以具备很好的特异性，而且可以实现对N-1,N-2代谢产物的监测。

表1：寡核苷酸生物分析策略的应用和对比

图三：LCMS平台：TripleQuad+,ABSciex

图四ELISA平台：MicroplatereaderM5e

图五qPCR平台：quantstudio7

药明康德苏州非临床生物分析团队于年3月为一例脂质纳米制剂反义RNA新药建立了LCMS分析方法，在方法开发的过程中，根据寡核苷酸的特点选择复合萃取剂，有效的从血浆中将寡核苷酸提取出来，回收率可达80%以上。色谱方面，应用离子对试剂实现了化合物的良好稳定保留，分析方法各方面均符合行业指导原则的要求，灵敏度较客户原分析方法提高了10倍，线性范围拓宽至倍。能够更好的满足非临床PK,TK的检测需求。借助药明LTD非临床到临床一站式生物分析服务平台，客户已拟定由上海临床生物分析团队承接该项目的临床分析工作。药明康德生物分析部临床团队将继续支持客户该项目的临床需求。

结语和展望

随着生物分析领域对于寡核苷酸药物研究经验的不断积累，以及新的分析技术的涌现，将为寡核苷酸药物的药代动力学研究提供更广阔的思路，和更精准高效的分析检测。这也将推动全球精准医疗事业的蓬勃发展，为人类大健康事业贡献力量。

参考文献：

1.VictorJDzau,GeoffreySGinsburg,KarenVanNuys,DavidAgus,DanaGoldman.Aligningincentivestofulfilthepromiseofpersonalizedmedicine,Lancet,():–()

2.KoleR,KrainerAR,AltmanS.RNAtherapeutics:beyondRNAinterferenceandantisenseoligonucleotides.Nat.Rev.DrugDiscov.11(2),–().

3.Muntoni,F.Wood,M.J.A.TargetingRNAtotreatneuromusculardisease.Nat.Rev.DrugDiscov.10,().

4.Opalinska,J.B.Gewirtz,A.M.Nucleic-acidtherapeutics:basicprinciplesandrecentapplications.Nat.Rev.DrugDiscov.1,–(2).

5.Dias,N.Stein,C.A.Antisenseoligonucleotides:basicconceptsandmechanisms.Mol.CancerTher.1,–(2).

6.Eder,P.S.,DeVine,R.J.,Dagle,J.M.Walder,J.A.Substratespecificityandkineticsofdegradationofantisenseoligonucleotidesbya3?exonucleaseinplasma.AntisenseRes.Dev.1,–().

7.Watanabe,T.A.,Geary,R.S.Levin,A.A.PlasmaproteinbindingofanantisenseoligonucleotidetargetinghumanICAM?1(ISIS).Oligonucleotides16,–(6).

8.KhvorovaAandJKWatts.Thechemicalevolutionofoligonucleotidetherapiesofclinicalutility.NatBiotechnol35:–().

9.MorellAG,GGregoriadis,IHScheinberg,JHickmanandGAshwell..Theroleofsialicacidindeterminingthesurvivalofglycoproteinsinthecirculation.JBiolChem:–()

10.NairJK,JLWilloughby,AChan,KCharisse,MRAlam,QWang,MHoekstra,PKandasamy,AVKel’in,etal..MultivalentN-acetylgalactosamine-conjugatedsiRNAlocalizesinhepatocytesandelicitsrobustRNAi-mediatedgenesilencing.JAmChemSoc:58–61().

11.Nishina,K.,Unno,T.,Uno,Y.,Kubodera,T.,Kanouchi,T.,Mizusawa,H.andYokota,T.EfficientinvivodeliveryofsiRNAtotheliverbyconjugationofalpha-Tocopherol.Mol.Ther.,16,–(8)

12.Wolfrum,C.,Shi,S.,Jayaprakash,K.N.,Jayaraman,M.,Wang,G.,Pandey,R.K.,Rajeev,K.G.,Nakayama,T.,Charrise,K.,Ndungo,E.M.etal.MechanismsandoptimizationofinvivodeliveryoflipophilicsiRNAs.Nat.Biotechnol.,25,–(7)

13.Sarett,S.M.,Werfel,T.A.,Lee,L.,Jackson,M.A.,Kilchrist,K.V.,Brantley-Sieders,D.andDuvall,C.L.LipophilicsiRNAtargetsalbumininsituandpromotesbioavailability,tumorpenetration,andcarrier-freegenesilencing.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(),

关于我们

药明康德测试事业部生物分析一站式服务平台旨在为全球客户提供全面的，专业的生物分析解决方案。药明康德生物分析部恪守全球最高质量监管标准，是符合GLP法规的检测机构，已多次通过国家药品监督管理局（NMPA）、美国食品药品管理局（FDA）、经济合作与发展组织（OECD）、欧洲药品管理局（EMA）、日本医药品医疗器械综合机构（PMDA）的全面核查。本部门拥有完善的大、小分子分析平台，为客户提供全方位的药物研发生物检测服务，拥有包括寡核苷酸、细胞基因治疗、双特异性抗体等新型药物形态的生物分析能力对于加速中国和国际客户的新药研发进程、助力全球医药行业发展具有非常特殊意义。

测试事业部（LaboratoryTestingDivision,LTD）

全球药物研发和医疗器械全方位测试平台，提供一流的测试解决方案，赋能科学家把理念转化成高效的医疗健康产品，加速从科研到临床及应用的转化，造福广大民众。

T：+86(21)

E：info_ltd

转载请注明：http://www.qzhgr.com/lctx/16927.html