思路迪博士大讲堂第二期一代测序及其

引子从年第一代DNA测序技术（Sanger法），至今三十多年时间，测序技术已取得相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。那么对于DNA测序，您了解它的原理吗？它有什么样的特点？它能给我们临床带来怎样的指引？思路迪博士大讲堂的博士们会给您带来全面清晰的解答。本期主讲博士袁明婧博士思路迪MSL厦门大学生命科学院肿瘤分子细胞生物学博士本期讲堂袁明婧博士将针对第一代测序为您做全面的阐述。第一代基因测序又叫做sanger法测序或双脱氧末端终止法测序sanger法测序的发现Sanger测序方法是20世纪70年代中期由美国生物化学家FrederickSanger发明的，Sanger先生也因为此项发明再一次获得了诺贝尔奖。上世纪90年代，历时13年具有划时代意义的人类基因组测序正是基于该技术完成的。Sanger测序经过38年的发展已经相当成熟完善，成本也降低了10倍以上，在二代测序发展迅猛的今天，Sanger测序仍然是基因检测的国际金标准。Sanger法测序的核心原理Sanger法测序又称双脱氧末端终止法测序，那么怎么理解双脱氧末端终止法测序呢？首先，它是一个DNA聚合反应，需要DNA模板（就是我们需要测序的序列）、DNA聚合酶、引物（与模板的起始序列互补，引导聚合反应开始）、4种脱氧核苷酸dNTP（合成DNA的元件）。测序引物与DNA模板结合后，dNTP在DNA聚合酶作用下延伸引物，从而合成与模板互补的新的DNA链。这有四组试剂，第一组含有A，G，T，C四种脱氧核苷酸，G这一种双脱氧核苷酸，依次类推......这个反应体系的核心在于，除了4种dNTP，还引入了一定比例的带不同荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。由于保留了5’羟基，ddNTP可以被聚合酶结合掺入到DNA链当中和上一个dNTP的磷酸基团“手拉手”（形成磷酸二酯键），但由于它缺乏3’羟基，无法和下一个dNTP的磷酸基团“手拉手”，DNA链的延伸就此终止，因此可以得到一系列起始位置相同（起始位置是由测序引物来决定的）以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，长度相邻的片段只相差一个碱基。通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶毛细管电泳，可以将这些DNA片段分离开来，ddNTP上的荧光信号被CCD光学系统捕获并识别，记录成可以阅读的峰图。图的横轴反映的是电泳时间，也可以看做是碱基的先后顺序，纵轴表示的是荧光强度，四种颜色分别对应四种碱基。沿着横轴，我们可以根据峰的颜色判读碱基顺序，峰越高越尖，就说明这个碱基检测的准确性越好。第一代基因测序的特点1、准确——过程细致，质控环节多，不容易污染，测序结果直观可视，不用建库因而假阳性结果极低。可以分辨出碱基置换、颠换、缺失和插入4种变异形式。因此Sanger测序是目前所有基因检测方法（包括荧光定量PCR中的Taqman探针法、普通PCR法、基因芯片法、二代测序法等）的金标准。科研领域发表基因检测相关文章，通常需要有sanger测序验证数据予以支持。2、针对个性化基因检测有价格优势——由于应用于临床的测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger测序正好具备这个特点，不仅可以进行个性化位点检测，还可以任意选择单项测序，因而非常适用于临床。3、灵敏度较低——Sanger测序法的检测灵敏度约10～15%.肿瘤标本中突变型等位基因的比例可以在0%～%之间各种比例都有可能，那么对于那些突变比例低于10%～15%的标本，如果用一代测序的方法进行检测，就很难发现突变了。4、通量小，成本高——只能逐段测序，通量小，无法完成全基因组层面的分析。而且一代测序速度比较慢、检测时间比较长。5、只能检测到部分突变形式比如基因重排、融合、扩增均无法检测一代测序的临床应用1、应用于医学测序、健康管理和基因潜力开发的精准检测Sanger测序已应用于肿瘤诊断、病情监测、预后和治疗等临床实践中。比如对BRCA基因或APC基因的检测分析，可用于早期发现乳腺癌或结肠癌的易感人群，从而对这些人群采取必要的干预措施。Sanger测序还可以对肿瘤靶向治疗药物相关基因的突变位点进行检测，例如在非小细胞肺癌的治疗中，靶向药吉非替尼/厄洛替尼用药前必须要检测EGFR基因的状态，可以针对EGFR基因突变热点所在的第18，19，20，21外显子设计特异性扩增和测序引物进行直接测序。2、为二代测序和芯片测序验证Sanger测序是NGS基因检测筛选单基因遗传病家系致病基因后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。值得注意的是，Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定基因突变。对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还是要依靠具有高通量测序能力的NGS。3.亲子鉴定或法医鉴定 　　这类技术是在sanger测序技术基础上发展起来的一个技术，所用仪器与sanger测序所用仪器一样，检测原理也一样。亲子鉴定可以通过对DNA遗传片段的检测，判定父母与子女之间的亲缘关系，而法医鉴定可以通过DNA测序提供死者或者嫌疑人的遗传信息。其实在二代测序之前，在肿瘤领域常见的几种检测方法如FISH，ARMS-PCR等已经被广泛应用于EGFR，HER2，KRAS等肿瘤相关基因的检测。下面是几种检测方法的比较：本期博士评语1、Sanger测序的优势在于读长长，准确性高，适合用于临床上单基因或者部分基因控制的疾病样本的检测和验证。对于这类单基因的检测，除非这个基因很长，或者有大片段的缺失、重复，否则在样本量比较少的情况下，用NGS来做单基因检测有点大材小用。2、一代测序比较适合对已知突变位点进行检测和验证，只能测出部分变异形式，灵敏度低，通量小，因而在对肿瘤基因组检测上，二代测序比一代测序更适合。我们目前对基因的了解还比较肤浅，有待进一步挖掘解读，这就需要将一代测序和二代测序这些检测方法都利用起来，发挥彼此的优势，更好的应用于临床和科研。博士大讲堂下期预告全新的二代测序NGS在一代测序的基础上做了什么样的改进？它能在临床上给您带来怎样的惊喜呢？我们下一期将为您揭晓，敬请期待！思路迪精准医药集团（3DMedicines）是一家专注肿瘤精准医疗的生物技术公司，秉承“科技改变世界”的理念，通过运用肿瘤基因组大数据，建立多级风险评估模型，开展肿瘤精准预防、肿瘤精准治疗和精准药物研发三大业务，致力于成为肿瘤精准医疗领域的创新型领导者。公司成立于年，总部设于上海，与国内医院达成合作，为不同人群提供精准医疗服务。更多信息，请登录思路迪官方网站：







































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