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分子诊断万花筒小白篇如何设计PC
号主按：无地自容，没话说。
特别说明：首先必须支持正版软件！其次，设计软件永远只是参考！换句话说设计出的、所谓的最好引物实际上未必是最好引物，常常需要对多对引物进行性能验证，即其灵敏度和特异性的比较。当然，如果没有软件辅助，你的设计工作一定会是繁琐凌乱的。
此次续讲，重点是手把手教你用PrimerPremier6软件来设计PCR引物。话不多说，直接打开软件后，界面如下图示。为什么要用PP6而不用PP5？在于前者集成了BLAST功能，可以随时比对引物的忠实性。当然，这个功能我一直没体验到。
（1）点击红框内的按钮，导入目标序列，如下图示。这里选用的是Humanenterovirus71VP1genecDNA中某段保守序列（如何查找保守序列，请参见“分子诊断万花筒”小白篇——如何设计PCR引物（一））（注意：该软件只认.fasta后缀格式文本。可以用.txt文件更改后缀变换，但须在其文本内容上添加”英文名称”，并另起一行添加序列。本次所用文本就是这么变换过来的：复制你想要的保守序列至txt文件，然后在第一行顶格输入EV71VP1，另起一行后粘贴序列，保存关闭。然后更改.txt后缀为.fasta。如何显示文件的后缀，请百度。
（2）设计PCR引物要根据具体PCR反应体系来定。因此，选择Tools进入ReactionConditions进行相关参数设置。如下图示，能设置的有四个参数：①NucleicAcidConcentration，即引物终浓度（加入后在反应中的浓度），默认值是0.25nM；②MonovalentIonConcentration，即单价阳离子浓度（指的是体系中的钾离子），默认值是50mM；③FreeMg++IonConcentration，即自由镁离子浓度，默认值是1.5mM；④TemperatureforFreeEnergyCalculation，即自由能计算温度（这是软件在计算引物自由能dG时采用的温度值），默认值是25℃。一般情况下，无需改动这些参数，除非是特殊用途的引物设计。
（3）设置好参数后，点击Analyze，进入PrimerSearch界面。如果想要更改引物设计参数，可以选择PrimerParameters进行修改。还是那句话，对于一般引物设计，除了Tm、引物长度Length和AmpliconLength，其他参数都默认值即可。另外，做多重PCR时AmpliconLength可以自行调整，以界定产物大小。
（4）设定好引物搜索参数后，点击search。就会在下面的PrimerProperties栏显示评分最高的一对引物。如果想查看其他引物，可以点击AllPrimers。同时，右上角框内会有箭头显示上下游的序列和位置。
（5）引物设计好后，点击File，然后选择ExportPrimerResults即可导出设计结果。
（6）PP6集成了BLAST功能，但破解版可能体验不了。所以，需要用其他方式来验证下所设计出的PCR引物对。直接进入NCBI的Primer-BLAST网页（白殿疯症状小孩白癜风能治好吗
