F10基因Val298Met纯合突变导致

作者：金艳慧郝秀萍程晓丽杨丽红陈怡谢海啸王莹宇王明山

选自：中华医学遗传学杂志,,36(03):-.

遗传性凝血因子Ⅹ(coagulationfactorⅩ，FⅩ)缺陷症是由位于人类染色体13q34的F10基因突变所致的一种罕见常染色体隐性遗传性疾病，在一般人群中纯合子发病率1∶，临床表现为不同程度的出血倾向[1]。研究表明，遗传性FⅩ缺陷症的临床表型具有异质性，其临床表型与等位基因突变的数量、突变位点对功能的影响程度及基因多态性等密切相关[2,3]。因此，鉴定基因突变类型对FⅩ缺乏症患者的临床诊断和治疗具有重要意义。本研究中我们对1个由近亲婚配引起纯合突变的遗传性FⅩ缺陷症家系成员进行凝血指标与基因水平的分析，探讨其突变基因型与表型的关系。

1　对象与方法

1.1　对象

遗传性FⅩ缺陷症家系来自江西省新余市(图1)。先证者(Ⅲ1)，女，28岁，年7月因"左腿、左膝关节肿痛"来我院急诊就诊。检查发现凝血酶原时间(prothrombintime，PT)为67.2s，活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，APTT)为.9s，FⅩ活性(FⅩactivity，FⅩ∶C)和FⅩ抗原(FⅩantigen，FⅩ∶Ag)分别为1%和8%，肝肾功能正常。先证者9岁时出现双膝关节肿大，未查明病因；年因"左大腿肿胀痛"就诊于上海医院，确诊为"凝血因子X缺陷症"，予输冰冻血浆后明显好转；既往有皮下淤青和月经量明显增多等症状，有3次输血史，其父母为姑表近亲婚配，其他家系成员均无自发出血症状。

图1

遗传性凝血因子X缺陷症家系图

名正常健康体检者作为凝血表型指标对照，其中男性66名、女性54名，平均年龄34岁(24～55岁)。均无肝肾功能疾病，无血栓或出血史。经知情同意后，抽取家系成员及正常对照体检者血样。

1.2　方法

1.2.1　引物

根据F10基因序列(GenBankAF)，应用PrimerPremier5.0?软件设计9对引物以覆盖F10基因的所有外显子及侧翼、5′和3′非翻译区序列(引物序列由上海医院王学锋教授馈赠)引物序列见参考文献[4]。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.2.2　样本采集及处理

抽取患者及其家系成员的外周静脉血样各2份以0.mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，一份离心后上层血浆用于各项凝血指标的检测；另一份用于DNA提取，在－40℃冰箱保存，用于PCR扩增。

1.2.3　血浆凝血指标检测

PT、APTT、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)、FⅩ∶C、因子Ⅶ活性(factorⅦactivity，FⅦ∶C)、因子Ⅱ活性(factorⅡactivity，FⅡ∶C)、因子Ⅴ活性(factorⅤactivity，FⅤ∶C)等凝血指标用一期凝固法在STAGOSTA-R全自动血凝仪上测定。FⅩ∶Ag采用ELISA法检测。

1.2.4　外周血基因组DNA提取

应用酚-氯仿法抽提先证者及家系成员外周血基因组DNA，应用核酸蛋白分析仪DU检测基因组DNA的浓度和纯度。

1.2.5　PCR扩增及电泳

PCR试剂为2×TaqPCRMasterMix(含染料)。PCR反应总体积为50μL，包括PCR扩增预混合溶液(TaqPCRMasterMix)、DNA模板、引物对和双蒸水。扩增产物用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.6　DNA测序分析

PCR产物割胶后送上海桑尼生物工程有限公司纯化后测序，所用测序仪为ABIPRISM。用Chromas软件将测序结果与美国NCBIGenBank所公布的F10基因序列AF进行比对，找寻基因突变，并对含有基因突变的序列进行反向测序确认。先扩增先证者F10所有外显子及侧翼序列，家系成员DNA则仅在先证者F10基因突变位点的相应外显子片段序列扩增后进行测序。

1.2.7　蛋白质生物学特性分析

用CLCGenomicsWorkbench7.5软件对g.GA(p.ValMet)突变的生物结构进行分析，并与正常FⅩ蛋白比较，推测基因突变影响FⅩ蛋白功能的可能机制。

2　结果

2.1　家系成员表型及凝血指标结果

先证者PT和APTT均明显延长，FⅩ∶C和FⅩ∶Ag明显减低；先证者父亲、母亲和弟弟的PT稍延长，FⅩ∶C和FⅩ∶Ag均约为正常对照的一半；先证者妹妹各项指标及家庭成员其他凝血指标均无明显异常，见表1。

表1

2.2　F10基因突变分析结果

先证者存在F10基因第8外显子g.GA纯合突变，导致p.ValMet错义突变；先证者父亲、母亲和弟弟均存在F10基因第8外显子g.GA杂合突变，妹妹F10基因为正常野生型，见表1、图2。从家系图分析推测先证者的g.GA纯合突变分别遗传自近亲婚配的父母。F10基因的其它外显子及侧翼、5′和3′非翻译区的测序未发现突变。

图2

遗传性FⅩ缺陷症家系F10基因第8外显子的测序结果　2A：先证者，g.GA纯合突变；2B：先证者弟弟，g.GA杂合突变；2C：先证者妹妹，g.G野生纯合型

图3

FⅩ的Val突变前后蛋白二级结构分析　3A：FⅩ发生ValMet突变；3B:F10基因参考序列AF

2.3　蛋白质生物学特性分析

2.3.1　保守性分析

将FⅩ与丝氨酸蛋白酶家族中的FⅦ、因子Ⅸ活性(factorⅨactivity，FⅨ∶C)、FⅡ和蛋白C(proteinC，PC)、蛋白S(proteinS，PS)等几种同源蛋白序列比对分析发现，第位缬氨酸(Val)在这些蛋白间并不保守，FⅡ、PC、PS的同源氨基酸残基分别为异亮氨酸(I)、异亮氨酸(I)和脯氨酸(P)。但FⅩ的Val在不同物种间(黑猩猩、猕猴、家犬、小家鼠、褐家鼠、家兔、牛和原鸡)同源序列的比对具有高度保守性。

2.3.2　蛋白二级结构分析

p．ValMet突变使第～位及第～位氨基酸的二级结构发生改变：正常FⅩ蛋白的第～位氨基酸(AAHCLYQ)由α螺旋(AAH)、β折叠(C)和α螺旋(LYQ)组成，发生突变后第～位氨基酸(AAHCLY)形成α螺旋结构；第～位氨基酸(ITFRM)形成的β折叠结构突变后发生改变(由ITFR组成)，见图3。

3　讨论

凝血因子X是一种肝脏合成的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，在凝血过程中转变为FⅩa后，与激活的FⅤ、Ca2＋、磷脂酰丝氨酸形成凝血酶原酶，共同激活凝血酶原为凝血酶，促进凝血酶的生成[5]。遗传性FⅩ缺陷症通常由F10基因突变所致，已报道的F10基因突变共约余种，其中错义突变占80%以上，无义突变、剪切位点突变、缺失突变和插入突变较少见(







































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