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引物选得好，测序没烦恼微生物
“微生物组”（Microbiome）是指由多种微生物聚居在一起形成的生态群落，从人和动物的肠道，到植物、土壤、海洋，它们无处不在，推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。
近年来，得益于低成本高通量基因测序技术的发展、计算和成像技术的改进，以及用于数据分析的生物信息学工具的革新等进展，高通量测序走下神坛，变得平易近人，使得更多的学科领域开始投入到微生物组学的研究中来。
对于微生物组学的研究，最常见的就是对微生物群落结构多样性的研究。也就是通过二代测序技术对16SrDNA/18SrDNA/ITS等序列进行测序，获得样品中的微生物群落组成以及相对丰度。探讨微生物多样性对于研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用有着重要的理论和现实意义。
那么问题来了
你真正了解16S测序吗？
为什么选择16S测序？
16S测序区域又该如何选择？
今天，我们就来聊聊16S测序中的引物选择。
首先要了解一下16S是个啥？
详情在之前的16S专题中详细说过，16S是一段序列，是原核微生物的“身份证”，你拿到这段序列，再跟数据库一比对，所有的物种信息你就完全明了了。因为操作简单，可行性高，比对信息准确，所以被认为是微生物多样性组学研究中最常用的检测手段。
16S说完了，再来了解一下16S测序区域是个啥？
16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因。16SrDNA基因全长bp，由9个可变区（V1-V9）和10个保守区组成。不同种类的细菌有相同的保守区序列和不同的可变区序列，因此可以根据保守区序列设计引物来扩增环境样品中所有细菌16SrRNA基因，而根据可变区序列来区分不同种类的细菌。
图SrDNA基因组成（绿色为可变区）
传统方法中最常用的引物是27F和R，几乎能扩增出完整的16SrRNA基因全长，由于目前二代高通量测序的读长限制，该引物不适用于高通量测序平台，但被广泛用于纯菌的分子鉴定。考虑到目前主流高通量测序平台读长的限制，只能对16SrDNA的某一段可变区进行测序。有文献中选择测单V区（V3/V4/V6），有的测双V区（V3-V4区或V4-V5区），还有的选择三V区（V1-V3区、V5-V7区或V7-V9区）进行16SrDNA测序。
那么问题又来了，到底选啥才能测的稳准狠啊？！
别急，且听小编慢慢道来~
想测的准，毫无疑问当然长度越长越准确嘛，但是出于经济实惠的角度考虑，其实测双V甚至单V区已经足够。一般而言，环境微生物组学常用的，也是认可度比较高的测序区域是V3-V4，V4-V5，或者单测V4区。
那不同的测序区域对数据结果有什么影响呢？
先来看看中科院周宁一老师于年发表在AEM杂志的一篇文章（IntragenomicHeterogeneityof16SrRNAGenesCausesOverestimationofProkaryoticDiversity），研究比较了16S不同区域的测序结果，所选择的引物如下：
研究结果显示，V4-V5区域是最佳的测序区域，造成的基因组内异质性最小。
也就是说一般会选择常用的V4-V5区，引物F/R或者F/R。这也是罗氏测序时代最常用的16S测序引物。
在Illumina时代，由于平台测序长度的限制，V4单区测序（F/R）被更为广泛地使用。也是地球微生物计划中推荐使用的引物序列（想了解地球微生物组戳这里：北京哪个医院治白癜风白癜风治疗医院
